Analiza sprzężeń – pośrednia diagnostyka genetyczna

Bezpośrednia diagnostyka genetyczna jest możliwa tylko wtedy, kiedy został zidentyfikowany i sklonowany zmutowany gen i jego prawidłowy odpowiednik, a co za tym idzie: znana jest ich sekwencja nukleotydowa. W obecnej chwili rozpoczęto ostatnią fazę poznawania genomu człowieka: zsekwencjonowano już całe ludzkie DNA, jednakże wiedza dotycząca fizycznego położenia poszczególnych sekwencji w wielu obszarach genomu jest jeszcze niepełna. Z tego powodu istnieje silna potrzeba wykorzystywania alternatywnych strategii diagnostycznych, opartych przede wszystkim na analizie zależności występujących pomiędzy nieznanym, zmutowanym genem a genami znanymi. W skrócie rzecz ujmując, chodzi o to, aby określić, czy u chorej osoby występuje ten sam kluczowy dla schorzenia fragment chromosomu, jak u innych chorych osób z jego rodziny. Wynika stąd, że powodzenie takiej strategii jest uzależnione od możliwości rozróżnienia chromosomu prawidłowego i zawierającego zmutowany gen. Można to osiągnąć między innymi dzięki badaniom naturalnej zmienności, czyli tzw. polimorfizmu DNA. Znane są dwie główne kategorie polimorfizmu: zmienność położenia i długości.

Polimorfizm położenia jest także nazywany polimorfizmem długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP, ang. restriction fragment length polymorphism). Jest to metoda wykorzystująca zjawisko osobniczej zmienności sekwencji DNA. Otóż wykazano, że pomiędzy dwoma homologicznymi kopiami DNA pochodzącymi od dwóch różnych osób występują różnice z przybliżoną częstością ok. 1 na 200 do 500 nukleotydów. Z reguły do zamiany pojedynczej pary zasad dochodzi w miejscach niekodujących, ale czasami dotyczy ona także genów, co jednak niekoniecznie musi wywierać wpływ na kodowane białko (por. rozdział „Mutacje”). Zmiany te mogą prowadzić do powstawania lub, wręcz przeciwnie, do zaniku miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne. DNA poddawany działaniu tych enzymów zostanie zatem pocięty na odcinki nierównej długości, co następnie, dzięki użyciu znakowanych sond genetycznych, hybrydyzujących z fragmentami w okolicy miejsc restrykcji jest możliwa ich detekcja przy wykorzystaniu analizy metodą Southerna.

Wyobraźmy sobie teraz, że dwoje heterozygotycznych rodziców jest nosicielami mutacji przekazywanej autosomalnie recesywnie. W prawidłowym chromosomie są dwa miejsca rozpoznawane przez restryktazę, odległe o 7,6 tysięcy par zasad, podczas gdy na drugim chromosomie zawierającym zmutowany gen stwierdza się również niezależny od tej mutacji polimorfizm sekwencji, którego skutkiem jest powstanie dodatkowego, trzeciego miejsca rozpoznawanego przez restryktazę, odległego od poprzednich o 0,8 i 6,8 tysięcy par zasad. Zatem u heterozygoty przy użyciu metody Southerna można wykazać oprócz prążka odpowiadającego 7,6 tysięcy par zasad także drugi, odpowiadający fragmentowi długości 6,8 tysięcy par zasad. Dzięki tej technice jest zatem możliwe odróżnienie tych członków rodziny, którzy posiadają obydwa prawidłowe chromosomy od tych, którzy są nosicielami schorzenia i tych, którzy obydwa chromosomy mają zmutowane. Jeśli znane są choćby częściowo sekwencje tych fragmentów, można do ich identyfikacji wykorzystywać także reakcję PCR.


Podobne możliwości jak RFLP, stwarza także zmienność liczby powtarzających się krótkich fragmentów DNA. Ponieważ liczba powtórzeń tych sekwencji jest bardzo zmienna u różnych ludzi, stwarza to duże możliwości diagnostyczne przy wykorzystaniu analizy sprzężeń. Biorąc pod uwagę długość, czy raczej krótkość omawianych sekwencji, można mówić o nieco dłuższych minisatelitach (motywy 15-70 nukleotydowe powtarzające się przez 1-3 tysięcy par zasad) i krótkich mikrosatelitach (2-6 nukleotydów powtarzających się na odcinku krótszym niż tysiąc par zasad).

Istota samej analizy jest analogiczna do przedstawionej powyżej (porównaj schemat). Załóżmy, że w danych trzech allelach – nazwijmy je A, B i C – określonego odcinka pewnego chromosomu u rodziców występują różne liczby mikrosatelit, a tylko na jednym z nich – C – znajduje się zmutowany gen odpowiedzialny za schorzenie przekazywane autosomalnie dominująco. Dzięki temu pojawia się możliwość zdiagnozowania schorzenia u dzieci i to wtedy, kiedy jeszcze nie wystąpią żadne jego objawy. Wystarczy stwierdzić, czy na którymś z chromosomów obecnych u dzieci liczba powtórzeń mikrosatelit jest taka jak na allelu C – jeśli jest, stanowi to pośredni dowód na obecność zmutowanego genu.

Możliwości analizy sprzężeń wykorzystujące zmienność liczby powtórzeń mikrosatelit są tak duże, że jest ona jednym z głównych narzędzi służących do tworzenia ludzkiej mapy genetycznej. Już teraz istnieje możliwość analizy sprzężeń w obrębie wszystkich ludzkich chromosomów. Nie ma jednak róży bez kolców – należy pamiętać o tym, że analiza sprzężeń nie pozwala na bezpośrednią identyfikację samego zmutowanego genu, dlatego istnieje szereg ograniczeń w stosowaniu opisanych wyżej metod:

  • Aby analiza sprzężeń była użyteczna diagnostycznie, kilku członków danej rodziny musi się poddać badaniom. W przypadku choroby przekazywanej autosomalnie recesywnie, konieczne jest uzyskanie DNA od chorego dziecka, w celu zidentyfikowania rodzaju i liczby powtórzeń, których następnie będzie się poszukiwać u pozostałych osób.
  • Homologiczne chromosomy u badanych członków rodziny muszą się różnić pod względem liczby powtórzeń. Stanowi to znaczące ograniczenie, ponieważ w przypadku RFLP na jednym chromosomie musi być miejsce rozpoznawane przez używaną w analizie restryktazę, a na drugim nie; w przeciwnym przypadku przeprowadzenie badanie jest niemożliwe. Zwykle istnieją znacznie większe szanse na zidentyfikowanie heterozygotyczności w zakresie zmienności liczby mikrosatelit, dlatego ta metoda znajduje szersze zastosowanie.
  • Naturalne procesy zachodzące w genomie pomiędzy homologicznymi chromosomami, takie jak np. rekombinacja w czasie gametogenezy, mogą prowadzić do oddzielenia zmutowanego genu od „znacznikowego” odcinka DNA. Oczywiście, im bliżej zmutowanego genu znajduje się odcinek znacznikowy, tym mniejsze ryzyko odseparowania obydwu, jednakże czasem obydwa te odcinki są bardzo oddalone. Dlatego zjawiska takie mogą prowadzić do brzemiennych w skutki błędów diagnostycznych, na przykład w czasie badań prenatalnych.

Diagnostyka molekularna oparta na analizie sprzężeń jest użyteczna w okresie prenatalym lub po urodzeniu, w presymptomatycznej fazie choroby. Przy jej pomocy można diagnozować takie schorzenia jak chorobę Huntingtona, mukowiscydozę, wielotorbielowatość nerek. Jednakże, ze względu na większą specyficzność metod bezpośredniej diagnostyki genetycznej, stają się one metodami z wyboru, kiedy już zostanie zidentyfikowany uszkodzony gen. Pomimo to, jak już wspomniano przy omawianiu zespołu Marfana, w przypadkach, w których w obrębie jednego genu może dochodzić do licznych mutacji, na dodatek w różnych pozycjach, bezpośrednia diagnostyka genetyczna jest nieefektywna, ponieważ jedna sonda DNA może wykrywać tylko jedną mutację. W takich sytuacjach wykorzystuje się analizę sprzężeń.

 

Odwiedzający wpisali takie problemy:

analiza sprzężen.
Ostatnia edycja przez

Skomentuj jako pierwszy!

Dodaj komentarz

Przeczytaj poprzedni wpis:
Bezpośrednia diagnostyka genetyczna

Metody stosowane w przypadku bezpośredniej diagnostyki genetycznej są niezwykle czułe. Ilość DNA wystarczająca do postawienia diagnozy przy użyciu technik opartych...

Zamknij