Badania cytogenetyczne

CYTO- w złożeniach: komórka;  GENETYCZNE – tu: badanie materiału genetycznego.

Zdrowy człowiek posiada 23 pary (czyli 46 sztuk) chromosomów. Stosując odpowiednie techniki laboratoryjne można sklasyfikować (rozpoznać) chromosomy po układzie prążków jasnych i ciemnych.

chromosomy

Prążki chromosomów

Chromosomy 9 pary, wybarwione techniką GTG oraz idiogram:


badanie chromosomów, GTG

GTG – badanie chromosomów

Materiał do badania cytogenetycznego:

Materiał musi być jałowy, w sterylnym pojemniku, opisany, minimalny czas transportu i przechowywania(przechowywanie: krew: 24 h, T pok., 4 dni 4*C, płyn owodniowy: do 24 h, 4*C).

Hodowla limfocytów krwi obwodowej to 2 hodowle dla jednego pacjenta (czas:     72 h, T:          37*C).

Skład hodowli limfocytów:

  •  4 ml podłoża z antybiotykiem (np. gentamycyna)
  •  1 ml surowicy
  •  1 ml LF (czynnika wzrostu)
  •  1 ml krwi pacjenta

Hodowla komórek szpiku kostnego: 4 hodowle dla jednego pacjenta(Czas:     24 h i 48 h, T:          37*C, przepływ CO2).

Skład hodowli komórek szpiku kostnego :

  •  5 (4) ml podłoża z antybiotykiem –  np. Marrowmax
  •  (1 ml surowicy)
  •  1 ml szpiku pacjenta

 

Hodowla komórek z płynu owodniowego(badanie prenatalne): 2 hodowle dla jednej pacjentki. Czas     2-3  tygodnie, Temp.   37*C, Przepływ CO2, Dwie cieplarki.

Skład hodowli komórek z płynu owodniowego :

  •  6 ml podłoża z antybiotykiem –  np. Amniomax
  •  1 ml surowicy
  •  7 ml płynu owodniowego

Co około 7 dni wymiana podłoża.

Hodowla fibroblastów (tkanek): 2 hodowle dla jednego pacjenta. Czas:    około 1 – 2 tygodnie, Temp.   37*C, Przepływ CO2. Roztwór tkanki w kolagenazie (2,5 mg/ml, T pok.)

Skład hodowli fibroblastów :

  •  7 ml podłoża do tkanek z antybiotykiem ( np. gentamycyna)
  •  2 ml tkanki

Podłoże Eagl’a: 10% surowicy, 1% r-r L-Glutaminy, 80u/0,5 l gentamycyny

 

Zakładanie hodowli materialu genetycznego

Zakładanie hodowli i badania.

Izolacja materiału genetycznego

krew szpik pł. owod. tkanki
Kolcemid 2 krople30-40 min 2 krople1-1,5 h 7-8 kropli3 h 7-8 kropli3h
Zwir. podłoża 1500 g / 8 min  (OSAD)
Szok osmotyczny KCl 8 min 30 min 20 min 20 min
Zwir. 1500 g / 8 min (OSAD)
UtrwalaczMetanol:kwas octowy 3:1 30 min3x 30 min3x 30 min3x 30 min3x
Zwir. 1500 g / 8 min (OSAD)
przechowywanie -20*C -20*C -20*C -20*C

 Metody barwienia chromosomów

Symbol prążków Technika barwienia odczynniki Zastosowanie
G GTG trypsyna, odczynnik Giemzy Podstawowa, wszystkie chromosomy
CBG Ba(OH)2, odczynnik Giemzy Centromery, heterochromatyna chromosomów 1, 9, 16, Y
Ag-NOR  AgNO3 Organizatory jąderkotwórcze chr. 13, 14, 15, 21, 22
QFQ, QFH  fluorochrom Wszystkie chromosomy, satelity i centromery akrocentryków, warianty chromosomu Y. Fluorescencyjna
RBG  BrdU, odczynnik Giemzy Wszystkie chromosomy, aberracje w regionach dystalnych
DAPI  DAPI Wszystkie chromosomy, fluorescencyjna
RBA BrdU, odczynnik Giemzy Nieaktywny chromosom X

źródło: Biologia molekularna w medycynie. PWN 2001. pod red. J. Bala

Technika GTG

Podstawowa technika barwienia chromosomów. Analiza aberracji liczbowych i strukturalnych. Prążki jasne – aktywne transkrypcyjnie, bogate w pary AT, a prążki ciemne – nieaktywne transkrypcyjnie, bogate w pary GC.

GTG:

  •  15 metafaz o odpowiedniej rozdzielczości prążkowej
  •  Co najmniej 2 kariogramy
  •  3 komórki z brakującym chromosomem lub dwie z dodatkowym = analiza 50 metafaz

Technika CBG

Barwienie regionów centromerowych chromosomów oraz heterochromatyny okołocentromerowej chromosomów 1, 9, 16, Y.

Technika Ag-NOR

Barwienie organizatorów jąderkotwórczych chromosomów akrocentrycznych: 13, 14, 15, 21, 22

Technika RBG

Barwienie wszystkich chromosomów, szczególnie w przypadku podejrzenia aberracji w dystalnych regionach chromosomów.

Prążki Q

Barwienie wszystkich chromosomów, wariantów morfologicznych chromosomu Y, satelitów i regionów centromerowych chromosomów akrocentrycznych.

Rozdzielczość prążkowa: liczba prążków w haploidalnym zestawie chromosomów.

Najmniejsza rozpoznawalna aberracja:

  • 7-10 x 106 pz przy rozdzielczości 400 prążków
  • 2-5 x 106 pz  przy rozdzielczości 850 prążków
Liczba punktów Li pr. w hapl zest. chr. omówienie
0 brak Nie jest możliwa jednoznaczna identyfikacja chromosomów
2 ~150 Możliwa identyfikacja chr., można odróżnić 8 od 9 i 4 od 5.
4 ~400 2 ciemne prążki na 8p i 9p, 3 ciemne prążki w środkowej części 5q
6 ~550 4 ciemne prążki na 18q i trzy na 11p. Rozdzielone są 7q33 i 7q35. Widoczny prążek 22q13.2.
8 ~850 Widoczne są 6q24, 6q25.2 i 6q26. Można rozróżnić pr. 11p14.1 i 14.3. Na 20p co najmniej 2 ciemne prążki.

źródło: Diagnostyka Laboratoryjna. Tom 37. 2001. Supl. I.

Ocena punktowa preparatu

  •  Rozdzielczość prążkowa: 2-6 pkt
  •  liczba płytek metafazalnych   ≥20    +2 pkt lub  1-20   +1 pkt
  •  rozproszenie chromosomów – jeśli słabe:   -1  lub -2 pkt

Minimalny standard jakości preparatów chromosomowych w odniesieniu do wskazania do oceny kariogramu.

wskazanie Wymagana liczba punktów
dla liczby prążków dla jakości i li. pł. met całkowita
Aneuploidia chromosomowa 2 1 3
Znana aberracja strukturalna 3 1 4
Niepow. rozrodu, dysmorfia, wady rozwojowe, opóźnienie rozwoju 5 1 6
Zespół mikrodelecji 7 1 8

Czas badania (górna granica):

  • Płyn owodniowy:            21 dni (zalecane 17 dni)
  •  kosmówka:                      20 dni
  •  krew – badanie zwykłe oraz inne tkanki  nienowotworowe:             28 dni (zalecane 14 dni)
  •  krew, badanie  pilne:     10 dni.

 

Tags: , ,

Ostatnia edycja przez

Skomentuj jako pierwszy!

Dodaj komentarz

Przeczytaj poprzedni wpis:
Choroby skóry kończyn

Lista chorób kończyn górnych i dolnych. (więcej…)

Zamknij