Bezpośrednia diagnostyka genetyczna

Metody stosowane w przypadku bezpośredniej diagnostyki genetycznej są niezwykle czułe. Ilość DNA wystarczająca do postawienia diagnozy przy użyciu technik opartych na hybrydyzacji molekularnej może być otrzymana z zaledwie około 100000 komórek. Wykorzystanie techniki PCR (ang. polymerase chain reaction, łańcuchowa reakcja polimerazy) umożliwia wielomilionową amplifikację DNA lub RNA, co – przynajmniej teoretycznie – umożliwia postawienie diagnozy na podstawie DNA zawartego w jednej komórce. Dzięki temu niewielkie ilości krwi (w przypadku metod stosowanych w medycynie sądowej wystarcza nawet zaschnięta plama krwi) zawierają wystarczające dużo DNA, aby przeprowadzić amplifikację przy użyciu PCR.

Drugą istotną cechą testów bezpośrednio wykorzystujących DNA jest to, że są niezależne od tego, czy produkt białkowy badanego genu w ogóle jest produkowany i to nie tylko wtedy, kiedy zaburzenie produkcji jest rezultatem mutacji per se, ale również wtedy, gdy badane białko w ogóle nie podlega ekspresji w określonej tkance (np. w DNA otrzymywanym z limfocytów można badać mutacje w obrębie genów podlegających ekspresji wyłącznie w ośrodkowym układzie nerwowym). Wynika to z faktu, że wszystkie komórki somatyczne zawierają identyczny materiał genetyczny, a zatem i identyczne mutacje.

Dzięki tym zaletom metody diagnostyki molekularnej zdobywają coraz to nowe dziedziny medycyny, wliczając w to diagnostykę prenatalną: wystarczająca do postawienia diagnozy ilość DNA może być pozyskana już w pierwszym trymestrze ciąży.


Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

Jedną z najbardziej dynamicznie rozwijających się metod analitycznych jest stojąca na pograniczu tradycyjnego kariotypowania i diagnostyki genetycznej hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (ang. fluorescent in situ hybridization, FISH). Stanowi ona znaczące rozszerzenie potencjału diagnostycznego rutynowo wykonywanych klasycznych badań cytogenetycznych.

Jedną z ważniejszych zalet techniki FISH jest możliwość badania genomu niezależnie od fazy cyklu komórkowego. Jak wiadomo, kariotypowanie jest możliwe tylko w przypadku jąder komórkowych znajdujących się w trakcie podziału, kiedy homologiczne chromosomy ulegają rozdzieleniu. Podział komórkowy można sztucznie indukować dodając do środowiska substancje mitogenne, jednakże czasami pewne względy przemawiają przeciwko takiemu postępowaniu. Problem ten można obejść, a całą procedurę znacząco uprościć wykorzystując sondy molekularne, czyli znakowane, na przykład fluorochromem, sekwencje oligonukleotydów komplementarne do badanych fragmentów chromosomów.

Dzięki takim sondom możliwe jest nie tylko identyfikowanie i zliczanie chromosomów, ale również wykrywanie obecności bądź braku pojedynczych genów, a także wykazywanie niewielkich nawet aberracji, np. mikrodelecji oraz złożonych translokacji, niewykrywalnych metodami klasycznymi. Nowe aplikacje FISH pozwalają na równoczesne wykorzystywanie wielu fluorochromów pobudzanych do świecenia przez różne długości fal, dzięki czemu możliwa stała się wizualizacja wszystkich chromosomów jednocześnie. Najnowszym hitem diagnostycznym jest tzw. kariotypowanie spektralne (ang. spectral karyotyping, SKY), w którym wykorzystuje się mieszaninę kilku, zazwyczaj pięciu, różnych sond znakowanych różnymi fluorochromami. Tęcza barw generowana przez oświetlone jednocześnie fluorochromy jest następnie precyzyjnie identyfikowana przez analizator obrazu sprzężony z komputerem.

Metody wykorzystujące PCR

Istnieje wiele metod bezpośredniej diagnostyki genetycznej, opartych na detekcji istotnych zmian ilościowych w DNA, które wykorzystują możliwości, jakie stwarza PCR. Istota łańcuchowej reakcji polimerazy jest zapewne doskonale czytelnikowi znana, jednakże dla porządku należy przypomnieć jej ideę.

W etapie 1 (por. ryc. 6.5), do natywnego DNA dodaje się roztwór zawierający termostabilną polimerazę uzyskaną z bakterii termofilnych, oraz w dużym nadmiarze: startery (ang. primer, oligonukleotydy komplementarne do odcinków DNA oskrzydlających badane miejsce) i mononukleotydy. Ogrzanie mieszaniny do ponad 90 °C umożliwia rozdzielenie dwuniciowego DNA na pojedyncze nici (etap 2). W czasie oziębiania (etap 3) do ok. 70 °C najpierw odpowiednie startery hybrydyzują z poszczególnymi niciami, a następnie polimeraza w ok. 50 °C dobudowuje komplementarną nić z mononukleotydów (etap 4). Każdy z nowo powstałych dwuniciowych fragmentów DNA staje się matrycą w kolejnym cyklu (etap 1), a ponieważ za pierwszym razem dodano nadmiar starterów i mononukleotydów, zaś polimeraza jest termostabilna, można niezwłocznie przejść do następnego etapu. Teoretyczna wydajność reakcji jest równa A x 2n, gdzie A – wyjściowa liczba cząsteczek DNA, n – liczba cykli. W praktyce wystarczające jest przeprowadzenie ok. 30 cykli.


Poniżej zostaną one omówione na przykładach:

  • Jedna z technik opiera się na fakcie, że pewne mutacje prowadzą do zmiany lub usunięcia określonych sekwencji DNA, rozpoznawanych przez bakteryjne enzymy restrykcyjne. Tak dzieje się na przykład z genem kodującym czynnik V – białkiem uczestniczącym w kaskadzie krzepnięcia. Mutacje dotyczące czynnika V są najczęstszą wrodzoną przyczyną nadkrzepliwości. Ekson 10 i sąsiadujący intron genu kodującego czynnik V posiadają dwa miejsca restrykcyjne rozpoznawane przez endonukleazę Mnl 1, odległe o 37 nukleotydów. Tranzycja G è A w eksonie uniemożliwia rozpoznanie miejsca cięcia przez restryktazę. Aby wykryć mutację, do dwóch osobnych mieszanin zawierających prawidłowy i „podejrzany” DNA dodaje się specjalnie skonstruowane startery, wiążące się z miejscem odległym o 163 pary zasad od końca 5’ (tu polimeraza rozpoczyna reakcję) i startery wiążące się z miejscem oddalonym od końca 3’ o 67 nukleotydów (stanowiącej koniec duplikowanej nici), a następnie roztwory te poddawane są reakcji PCR. Następnie produkt tej reakcji – miliony kopii długiej na 267 par zasad nici DNA trawi się enzymem Mnl 1. Wynikiem trawienia są – w przypadku prawidłowego genu – trzy fragmenty DNA długości 37, 67 i 163 nukleotydów, zaś w przypadkach mutacji – jedynie dwa produkty, długości 67 i 200 nukleotydów. Elektroforeza na żelu poliakrylamidowym umożliwia rozdzielenie tych fragmentów, a uwidocznić je można barwieniem bromkiem etydyny, fosforyzującym w świetle ultrafioletowym. W ten sposób możliwe jest także wykrywanie heterozygotycznych nosicieli tej mutacji.
  • W przypadkach, w których miejsce ulegające mutacji nie jest rozpoznawane przez żadną ze znanych restryktaz, wykorzystuje się technikę allelo-specyficznej hybrydyzacji oligonukleotydów. Np. niektóre przypadki niedoboru α1-antytrypsyny związane są z tranzycją G è A w piątym eksonie (powstaje wtedy tzw. allel Z). DNA prawidłowy i „podejrzany” są amplifikowane w podobny jak wyżej sposób, przy użyciu starterów po obydwu flankach miejsca mutacji. Zamplifikowane produkty reakcji są następnie nakraplane na dwie bibuły filtracyjne (ang. dot blot), na których się osadzają. Następnie na te same miejsca nakraplane są roztwory zawierające syntetyczne oligonukleotydy, komplementarne do prawidłowego i zmutowanego odcinka badanego genu i wyznakowane pierwiastkiem promieniotwórczym. Odpowiadające sobie odcinki hybrydyzują z kontrolnym i zmutowanym DNA, przy czym ściśle kontrolowane warunki reakcji pozwalają na powstawanie jedynie stabilnych, w pełni komplementarnych fragmentów (prawidłowy oligonukleotyd i zmutowany odcinek DNA mogą się połączyć, jednakże na skutek mutacji punktowej w badanym DNA, nie będzie to połączenie stabilne i vice versa). W efekcie próbka kontrolna, zawierająca prawidłowy DNA, hybrydyzuje z prawidłowym oligonukleotydem i jedynie ta kropka daje silny sygnał na detektorze promieniowania, którym z reguły jest błona fotograficzna; próbka od homozygoty z mutacją nie będzie hybrydyzować z prawidłowym oligonukleotydem i będzie niewidoczna na detektorze. Odwrotnie będzie wyglądać sytuacja na drugiej bibule, na którą nakraplano roztwór zawierający nukleotyd komplementarny do zmutowanego DNA. W przypadku osób heterozygotycznych, reakcja zajdzie na obydwu bibułach, ale sygnał wykrywany przez detektor będzie w każdym przypadku o połowę słabszy, ponieważ w każdym przypadku tylko połowa produktu reakcji PCR będzie hybrydyzować (patrz schemat).
  • Także mutacje obejmujące większy fragment DNA – np. delecje czy insercje – również można wykrywać wykorzystując PCR. Jak opisano wcześniej, w przypadku zespołu łamliwego chromosomu X, dochodzi do zwiększenia liczby sekwencji trójnukleotydowych. Ponownie, jak to opisano wyżej, używa się pary starterów komplementarnych do DNA na obydwu flankach zmienionego rejonu, a następnie amplifikuje się cały obszar. Z powodu dużego zróżnicowania liczby powtórzeń trójkowych sekwencji, w zależności od tego, czy jest to norma, faza premutacji, czy mutacja, rozmiary produktów różnych reakcji PCR (w których amplifikuje się DNA od różnych pacjentów) mogą mieć różną wielkość, co można uwidocznić dzięki elektroforezie na żelu. Jeśli powtórzeń trójnukleotydowych jest tak dużo, że DNA jest zbyt długi do analizy przy pomocy klasycznej PCR, można wykorzystać inne metody analityczne, na przykład analizę znaną jako metoda Southerna.

 

Ostatnia edycja przez

Skomentuj jako pierwszy!

Dodaj komentarz

Przeczytaj poprzedni wpis:
Diagnostyka chorób genetycznych

W diagnostyce chorób genetycznych wykorzystuje się dwie zasadnicze grupy metod analitycznych: analizę cytogenetyczną i analizę molekularną. (więcej…)

Zamknij