Zdrowy człowiek posiada 23 pary (czyli 46 sztuk) chromosomów. Stosując odpowiednie techniki laboratoryjne można sklasyfikować (rozpoznać) chromosomy po układzie prążków jasnych i ciemnych.
Chromosomy 9 pary, wybarwione techniką GTG oraz idiogram:
Materiał do badania cytogenetycznego:
- krew żylna (2-10 ml) – heparyna
- fibroblasty (wycinek)
- szpik kostny (4 ml) – heparyna płynna sodowa
- krew pępowinowa (1-2 ml) – heparyna
- płyn owodniowy (15-20 ml)
- wycinki guza
- fragmenty tkanek (kosmówka, jajniki)
Materiał musi być jałowy, w sterylnym pojemniku, opisany, minimalny czas transportu i przechowywania(przechowywanie: krew: 24 h, T pok., 4 dni 4*C, płyn owodniowy: do 24 h, 4*C).
Hodowla limfocytów krwi obwodowej to 2 hodowle dla jednego pacjenta (czas: 72 h, T: 37*C).
Skład hodowli limfocytów:
- 4 ml podłoża z antybiotykiem (np. gentamycyna)
- 1 ml surowicy
- 1 ml LF (czynnika wzrostu)
- 1 ml krwi pacjenta
Hodowla komórek szpiku kostnego: 4 hodowle dla jednego pacjenta(Czas: 24 h i 48 h, T: 37*C, przepływ CO2).
Skład hodowli komórek szpiku kostnego :
- 5 (4) ml podłoża z antybiotykiem – np. Marrowmax
- (1 ml surowicy)
- 1 ml szpiku pacjenta
Hodowla komórek z płynu owodniowego(badanie prenatalne): 2 hodowle dla jednej pacjentki. Czas 2-3 tygodnie, Temp. 37*C, Przepływ CO2, Dwie cieplarki.
Skład hodowli komórek z płynu owodniowego :
- 6 ml podłoża z antybiotykiem – np. Amniomax
- 1 ml surowicy
- 7 ml płynu owodniowego
Co około 7 dni wymiana podłoża.
Hodowla fibroblastów (tkanek): 2 hodowle dla jednego pacjenta. Czas: około 1 – 2 tygodnie, Temp. 37*C, Przepływ CO2. Roztwór tkanki w kolagenazie (2,5 mg/ml, T pok.)
Skład hodowli fibroblastów :
- 7 ml podłoża do tkanek z antybiotykiem ( np. gentamycyna)
- 2 ml tkanki
Podłoże Eagl’a: 10% surowicy, 1% r-r L-Glutaminy, 80u/0,5 l gentamycyny
Izolacja materiału genetycznego
krew | szpik | pł. owod. | tkanki | |
Kolcemid | 2 krople30-40 min | 2 krople1-1,5 h | 7-8 kropli3 h | 7-8 kropli3h |
Zwir. podłoża | 1500 g / 8 min (OSAD) | |||
Szok osmotyczny KCl | 8 min | 30 min | 20 min | 20 min |
Zwir. | 1500 g / 8 min (OSAD) | |||
UtrwalaczMetanol:kwas octowy 3:1 | 30 min3x | 30 min3x | 30 min3x | 30 min3x |
Zwir. | 1500 g / 8 min (OSAD) | |||
przechowywanie | -20*C | -20*C | -20*C | -20*C |
Metody barwienia chromosomów
Symbol prążków | Technika barwienia | odczynniki | Zastosowanie |
G | GTG | trypsyna, odczynnik Giemzy | Podstawowa, wszystkie chromosomy |
C | CBG | Ba(OH)2, odczynnik Giemzy | Centromery, heterochromatyna chromosomów 1, 9, 16, Y |
Ag-NOR | – | AgNO3 | Organizatory jąderkotwórcze chr. 13, 14, 15, 21, 22 |
Q | QFQ, QFH | fluorochrom | Wszystkie chromosomy, satelity i centromery akrocentryków, warianty chromosomu Y. Fluorescencyjna |
R | RBG | BrdU, odczynnik Giemzy | Wszystkie chromosomy, aberracje w regionach dystalnych |
DAPI | – | DAPI | Wszystkie chromosomy, fluorescencyjna |
RBA | – | BrdU, odczynnik Giemzy | Nieaktywny chromosom X |
źródło: Biologia molekularna w medycynie. PWN 2001. pod red. J. Bala
Technika GTG
Podstawowa technika barwienia chromosomów. Analiza aberracji liczbowych i strukturalnych. Prążki jasne – aktywne transkrypcyjnie, bogate w pary AT, a prążki ciemne – nieaktywne transkrypcyjnie, bogate w pary GC.
GTG:
- 15 metafaz o odpowiedniej rozdzielczości prążkowej
- Co najmniej 2 kariogramy
- 3 komórki z brakującym chromosomem lub dwie z dodatkowym = analiza 50 metafaz
Technika CBG
Barwienie regionów centromerowych chromosomów oraz heterochromatyny okołocentromerowej chromosomów 1, 9, 16, Y.
Technika Ag-NOR
Barwienie organizatorów jąderkotwórczych chromosomów akrocentrycznych: 13, 14, 15, 21, 22
Technika RBG
Barwienie wszystkich chromosomów, szczególnie w przypadku podejrzenia aberracji w dystalnych regionach chromosomów.
Prążki Q
Barwienie wszystkich chromosomów, wariantów morfologicznych chromosomu Y, satelitów i regionów centromerowych chromosomów akrocentrycznych.
Rozdzielczość prążkowa: liczba prążków w haploidalnym zestawie chromosomów.
Najmniejsza rozpoznawalna aberracja:
- 7-10 x 106 pz przy rozdzielczości 400 prążków
- 2-5 x 106 pz przy rozdzielczości 850 prążków
Liczba punktów | Li pr. w hapl zest. chr. | omówienie |
0 | brak | Nie jest możliwa jednoznaczna identyfikacja chromosomów |
2 | ~150 | Możliwa identyfikacja chr., można odróżnić 8 od 9 i 4 od 5. |
4 | ~400 | 2 ciemne prążki na 8p i 9p, 3 ciemne prążki w środkowej części 5q |
6 | ~550 | 4 ciemne prążki na 18q i trzy na 11p. Rozdzielone są 7q33 i 7q35. Widoczny prążek 22q13.2. |
8 | ~850 | Widoczne są 6q24, 6q25.2 i 6q26. Można rozróżnić pr. 11p14.1 i 14.3. Na 20p co najmniej 2 ciemne prążki. |
źródło: Diagnostyka Laboratoryjna. Tom 37. 2001. Supl. I.
Ocena punktowa preparatu
- Rozdzielczość prążkowa: 2-6 pkt
- liczba płytek metafazalnych ≥20 +2 pkt lub 1-20 +1 pkt
- rozproszenie chromosomów – jeśli słabe: -1 lub -2 pkt
Minimalny standard jakości preparatów chromosomowych w odniesieniu do wskazania do oceny kariogramu.
wskazanie | Wymagana liczba punktów | ||
dla liczby prążków | dla jakości i li. pł. met | całkowita | |
Aneuploidia chromosomowa | 2 | 1 | 3 |
Znana aberracja strukturalna | 3 | 1 | 4 |
Niepow. rozrodu, dysmorfia, wady rozwojowe, opóźnienie rozwoju | 5 | 1 | 6 |
Zespół mikrodelecji | 7 | 1 | 8 |
Czas badania (górna granica):
- Płyn owodniowy: 21 dni (zalecane 17 dni)
- kosmówka: 20 dni
- krew – badanie zwykłe oraz inne tkanki nienowotworowe: 28 dni (zalecane 14 dni)
- krew, badanie pilne: 10 dni.
Skomentuj jako pierwszy!