Badania cytogenetyczne

CYTO- w złożeniach: komórka;  GENETYCZNE – tu: badanie materiału genetycznego.

Zdrowy człowiek posiada 23 pary (czyli 46 sztuk) chromosomów. Stosując odpowiednie techniki laboratoryjne można sklasyfikować (rozpoznać) chromosomy po układzie prążków jasnych i ciemnych.

Chromosomy 9 pary, wybarwione techniką GTG oraz idiogram:

Materiał do badania cytogenetycznego:

•  krew żylna (2-10 ml) – heparyna
•  fibroblasty (wycinek)
•  szpik kostny (4 ml) – heparyna płynna sodowa
•  krew pępowinowa (1-2 ml) – heparyna
•  płyn owodniowy (15-20 ml)
•  wycinki guza
•  fragmenty tkanek (kosmówka, jajniki)

Materiał musi być jałowy, w sterylnym pojemniku, opisany, minimalny czas transportu i przechowywania(przechowywanie: krew: 24 h, T pok., 4 dni 4*C, płyn owodniowy: do 24 h, 4*C).

Hodowla limfocytów krwi obwodowej to 2 hodowle dla jednego pacjenta (czas:     72 h, T:          37*C).

Skład hodowli limfocytów:

•  4 ml podłoża z antybiotykiem (np. gentamycyna)
•  1 ml surowicy
•  1 ml LF (czynnika wzrostu)
•  1 ml krwi pacjenta

Hodowla komórek szpiku kostnego: 4 hodowle dla jednego pacjenta(Czas:     24 h i 48 h, T:          37*C, przepływ CO2).

Skład hodowli komórek szpiku kostnego :

•  5 (4) ml podłoża z antybiotykiem –  np. Marrowmax
•  (1 ml surowicy)
•  1 ml szpiku pacjenta

 

Hodowla komórek z płynu owodniowego(badanie prenatalne): 2 hodowle dla jednej pacjentki. Czas     2-3  tygodnie, Temp.   37*C, Przepływ CO2, Dwie cieplarki.

Skład hodowli komórek z płynu owodniowego :

•  6 ml podłoża z antybiotykiem –  np. Amniomax
•  1 ml surowicy
•  7 ml płynu owodniowego

Co około 7 dni wymiana podłoża.

Hodowla fibroblastów (tkanek): 2 hodowle dla jednego pacjenta. Czas:    około 1 – 2 tygodnie, Temp.   37*C, Przepływ CO2. Roztwór tkanki w kolagenazie (2,5 mg/ml, T pok.)

Skład hodowli fibroblastów :

•  7 ml podłoża do tkanek z antybiotykiem ( np. gentamycyna)
•  2 ml tkanki

Podłoże Eagl’a: 10% surowicy, 1% r-r L-Glutaminy, 80u/0,5 l gentamycyny

 

Izolacja materiału genetycznego

	krew	szpik	pł. owod.	tkanki
Kolcemid	2 krople30-40 min	2 krople1-1,5 h	7-8 kropli3 h	7-8 kropli3h
Zwir. podłoża	1500 g / 8 min  (OSAD)
Szok osmotyczny KCl	8 min	30 min	20 min	20 min
Zwir.	1500 g / 8 min (OSAD)
UtrwalaczMetanol:kwas octowy 3:1	30 min3x	30 min3x	30 min3x	30 min3x
Zwir.	1500 g / 8 min (OSAD)
przechowywanie	-20*C	-20*C	-20*C	-20*C

 Metody barwienia chromosomów

Symbol prążków	Technika barwienia	odczynniki	Zastosowanie
G	GTG	trypsyna, odczynnik Giemzy	Podstawowa, wszystkie chromosomy
C	CBG	Ba(OH)2, odczynnik Giemzy	Centromery, heterochromatyna chromosomów 1, 9, 16, Y
Ag-NOR	–	AgNO3	Organizatory jąderkotwórcze chr. 13, 14, 15, 21, 22
Q	QFQ, QFH	fluorochrom	Wszystkie chromosomy, satelity i centromery akrocentryków, warianty chromosomu Y. Fluorescencyjna
R	RBG	BrdU, odczynnik Giemzy	Wszystkie chromosomy, aberracje w regionach dystalnych
DAPI	–	DAPI	Wszystkie chromosomy, fluorescencyjna
RBA	–	BrdU, odczynnik Giemzy	Nieaktywny chromosom X

źródło: Biologia molekularna w medycynie. PWN 2001. pod red. J. Bala

Technika GTG

Podstawowa technika barwienia chromosomów. Analiza aberracji liczbowych i strukturalnych. Prążki jasne – aktywne transkrypcyjnie, bogate w pary AT, a prążki ciemne – nieaktywne transkrypcyjnie, bogate w pary GC.

GTG:

•  15 metafaz o odpowiedniej rozdzielczości prążkowej
•  Co najmniej 2 kariogramy
•  3 komórki z brakującym chromosomem lub dwie z dodatkowym = analiza 50 metafaz

Technika CBG

Barwienie regionów centromerowych chromosomów oraz heterochromatyny okołocentromerowej chromosomów 1, 9, 16, Y.

Technika Ag-NOR

Barwienie organizatorów jąderkotwórczych chromosomów akrocentrycznych: 13, 14, 15, 21, 22

Technika RBG

Barwienie wszystkich chromosomów, szczególnie w przypadku podejrzenia aberracji w dystalnych regionach chromosomów.

Prążki Q

Barwienie wszystkich chromosomów, wariantów morfologicznych chromosomu Y, satelitów i regionów centromerowych chromosomów akrocentrycznych.

Rozdzielczość prążkowa: liczba prążków w haploidalnym zestawie chromosomów.

Najmniejsza rozpoznawalna aberracja:

• 7-10 x 106 pz przy rozdzielczości 400 prążków
• 2-5 x 106 pz  przy rozdzielczości 850 prążków

Liczba punktów	Li pr. w hapl zest. chr.	omówienie
0	brak	Nie jest możliwa jednoznaczna identyfikacja chromosomów
2	~150	Możliwa identyfikacja chr., można odróżnić 8 od 9 i 4 od 5.
4	~400	2 ciemne prążki na 8p i 9p, 3 ciemne prążki w środkowej części 5q
6	~550	4 ciemne prążki na 18q i trzy na 11p. Rozdzielone są 7q33 i 7q35. Widoczny prążek 22q13.2.
8	~850	Widoczne są 6q24, 6q25.2 i 6q26. Można rozróżnić pr. 11p14.1 i 14.3. Na 20p co najmniej 2 ciemne prążki.