Genetyczne podstawy choroby nowotworowej

Transformacja nowotworowa jest wynikiem zmian głównie w obrębie czterech różnych klas genów mających wpływ na proliferację komórek:

•  proto–onkogenów (czyli genów stymulujących wzrost),
•  genów supresorowych transformacji nowotworowej (zwanych też antyonkogenami, które hamują wzrost),
•  genów kontrolujących apoptozę (czyli zaprogramowaną śmierć komórki),
•  genów regulujących naprawę uszkodzonego DNA (jeżeli naprawa dotyczy właśnie genów należących do którejkolwiek z wyżej wymienionych trzech klas, wówczas geny regulujące naprawę DNA jednocześnie pośrednio wpływają na proliferację komórek).

Stopniowo, w wyniku akumulacji wielu zmian w DNA, nowotwór uzyskuje omówione uprzednio fenotypowe cechy złośliwości w procesie zwanym progresją. Poniżej omówimy podstawowe klasy genów biorących udział w transformacji nowotworowej i ich produkty białkowe.

Onkogeny

W czasie badań nad ostro transformującymi retrowirusami wykryto szereg genów indukujących transformację nowotworową komórek. Nazwano je wirusowymi onkogenami (genami wywołującymi nowotwory) (v–onc). Wkrótce okazało się, że prawie identyczne geny występują w komórkach prawidłowych gdzie są odpowiedzialne za procesy wzrostu i różnicowania komórek oraz pośredniczą w przekazywaniu sygnałów międzykomórkowych, szczególnie w czasie embriogenezy i procesów gojenia. Nazwano je protoonkogenami. W komórkach prawidłowych protoonkogeny występują z częstością 1 kopii na 1 haploidalny genom. Znajdują się one w stanie spoczynku lub ich transkrypcja, spełniając określone funkcje, jest ściśle kontrolowana a produkty białkowe mają bardzo krótki czas półtrwania. Onkogeny retrowirusów (v–onc) nie są pochodzenia wirusowego. Są one nieco zmodyfikowanymi genami prawidłowej komórki, które w przebiegu ewolucji zostały przypadkowo wbudowane do genomu retrowirusa pozostając pod kontrolą jego sygnałów transkrypcyjnych. Często w procesie wbudowywania genów komórkowych do genomu retrowirusa dochodziło do różnych zmian strukturalnych głównie mutacji dlatego v–onkogeny, są bardzo podobne do protoonkogenów komórki ale nie identyczne. Niestety, nic w przyrodzie (i w życiu człowieka) nie ma za darmo. Ostro transformujące wirusy, wbudowując do swojego genomu protoonkogeny komórkowe zyskały zdolność do wywoływania szybkiej transformacji nowotworowej. Koszta tej operacji okazały się jednak duże. W trakcie integracji z genomem komórkowym (czego skutkiem było następnie „porwanie” do swojego genomu protoonkogenów komórkowych) część genów własnych retrowirusów uległa delecji a wirusy te utraciły bezpowrotnie zdolność replikacji. Dlatego (z wyjątkiem wirusa mięsaka Rousa) mogą się one namnażać tylko w obecności wirusa pomocniczego, który dostarcza odpowiednich brakujących białek. Tak więc transformują ostro ale są replikacyjnie ułomne.

Nie wszystkie karcynogenne retrowirusy zawieraja v–onkogeny. Tzw. przewlekle transformujące retrowirusy wywołują transformację nowotworową inaczej a mianowicie za pomocą tzw. mutagenezy insercjonalnej która prowadzi do aktywacji protoonkogenu. Protoonkogen zmienia się w onkogen (c–onc) prowadząc do transformacji nowotworowej, jeżeli genom wirusa (nie zawierającego sekwencji transformujących) zostaje włączony w pobliże protoonkogenu albo wywołuje w nim zmiany strukturalne lub zmienia jego ekspresję pod wpływem swoich promotorów regulujących transkrypcję lub swoich sekwencji wzmacniających. Np. w wyniku integracji wirusa ALV. (ang. Avian Leukemia Virus – wirus białaczki ptasiej) w obrębie protoonkogenu erbB dochodzi do tworzenia receptora dla naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), który nie posiada części zewnątrzkomórkowej wiążącej ligand (którym jest naskórkowy czynnik wzrostu – EGF). Ponieważ EGFR jest białkiem transbłonowym biorącym udział w transdukcji sygnału po związaniu się ze swoim ligandem, gdy receptor ten nie ma części zewnątrzbłonowej nie jest już wrażliwy na EGF natomiast jest stale (konstytutywnie) aktywowany(tak jakby był na stałe związany z EGF) co prowadzi do transformacji nowotworowej. Na marginesie, przewlekle transformujące retrowirusy (które nic nie „ukradły” z genonu komórki) transformują powoli ale są replikacyjne kompetentne (tzn. nie potrzebują do rozmnażania się wirusów pomocniczych).

Nie tylko retrowirusy zawierają onkogeny (v–onc). Również w DNA z guzów niewirusowego pochodzenia występują onkogeny (c–onc). Okazało się, że DNA wielu nowotworów człowieka (m.in. raków jelita grubego, płuc, białaczek) zawiera aktywowany protoonkogen ras (podobny do v-ras występującego w wirusach mięsaka Harveya i Kirsten). Szereg mechanizmów (o nich poniżej) może prowadzić do aktywacji protoonkogenów czyli do zmiany ich struktury (w następstwie kodowane będą nieprawidłowe białka) lub do zaburzeń ich ekspresji. Aktywowany protoonkogen nazywamy komórkowym onkogenem (c–onc). Każdy wirusowy onkogen oznaczany jest trzyliterowym akronimem (pisanym kursywą) pochodzącym od angielskiej nazwy wirusa, w którym go wykryto. Np. v-sis od simian sarcoma virus. W nazwie protoonkogenu opuszcza się literkę v (np. sis), w nazwie onkogenu dodaje się przedrostek c (np. c-sis). Zidentyfikowano do tej pory około 60 onkogenów, niektóre jak np. c-erbB2 nie występują w retrowirusach. W zależności od funkcji onkoprotein, onkogeny można podzielić na kilka grup. Należą do nich białka jądrowe związane z regulacją proliferacji komórek, cytoplazmatyczne białka przekaźnikowe, czynniki wzrostu, receptory czynników wzrostu.

A zatem, protoonkogeny komórkowe mogą zostać aktywowane i prowadzić do transformacji nowotworowej na dwa sposoby albo przez transdukcję do genomu retrowirusów (powstają v– nc) albo przez zmiany ich struktury i funkcji na miejscu w komórce (powstają c–onc). Do mechanizmów, które prowadzą do aktywacji („niewinnych”) protoonkogenów i ich zmiany w („niebezpieczne”) onkogeny należą: zmiany w strukturze protoonkogenów lub zaburzenia regulacji ich ekspresji. Zmiany w strukturze spowodują syntezę nieprawidłowych strukturalnie i czynnościowo białek (onkoprotein). Wynikiem zaburzeń regulacji ekspresji będzie wzmocnienie lub zmniejszenie sygnałów kontrolujących wzrost i proliferację komórek. Na poziomie komórki, onkogeny prowadzą do transformacji nowotworowej (zmiany fenotypu) w sposób dominujący tzn. do wywołania efektu wystarczy tylko jeden zmutowany allel protoonkogenu. Poniżej omówimy mechanizmy aktywacji protoonkogenów:

1. Mutacje punktowe. Najlepiej zbadanym przykładem aktywacji poprzez mutacje punktowe jest onkogen ras (mechanizm działania patrz str. …). Mutacje genu ras są najczęstszą zmianą stwierdzaną w dominujących onkogenach nowotworów człowieka. Występują one w 10% – 20% wszystkich nowotworów człowieka np. w 90% raków trzustki i raków z przewodzików żółciowych, w około połowie raków tarczycy, endometrium, jelita grubego a także w części raków płuca i białaczek. Jednak mutacje ras nie są niezbędne w procesie karcinogenezy gdyż nie występują w innych rakach np. w rakach sutka lub szyjki macicy. Innym przykładem aktywacji poprzez punktową mutację jest c-fms w niektórych przypadkach ostrej białaczki szpikowej.

2. Amplifikacje genów. Aktywacja protoonkogenu może nastąpić przez zwielokrotnienie liczby kopii prawidłowego protoonkogenu w komórce nawet do kilkuset. W takim przypadku produkt genu jest prawidłowy natomiast znacznie zwiększa się ilość białka. Amplikacja może być widoczna w badaniach cytogenetycznych pod postacią tzw. minipar (ang. double minutes) czyli licznych bardzo małych chromosomów, albo regionów o zatartej strukturze prążkowej (ang. homogenous staining regions – HSR), które występują w chromosomach zawierających wiele kopii onkogenu (Ryc. 8.26.). Np. w 30% – 40% przypadków neuroblastoma można stwierdzić amplifikację N‑myc (który normalnie występuje na chromosonie 2p) pod postacią minipar lub HSR zintegrowanych z chromosomami 4,9,13. Amplifikacja erb-B2 występuje w raku sutka, N‑myc i L‑myc w drobnokomórkowym raku płuca a cykliny D w raku sutka i rakach płaskonabłonkowych. Na ogół amplifikacja protoonkogenów związana jest ze złym rokowaniem.

1.          Translokacje chromosomowe. Translokacje chromosomowe mogą spowodować przeniesienie protoonkogenu w sąsiedztwo promotora lub sekwencji wzmacniających (ang. enhancer) genów czynnych transkrypcyjnie co może spowodować nadekspresję protoonkogenu. Translokacje w pobliżu locus dla genów kodujących łańcuchy immunoglobulin są związane z chłoniakiem złośliwym typu B. Np. w chłoniaku Burkitta (lymphoma Burkitti) najczęściej występuje t (8;14) (q24; q32) (Ryc. 8.27.). W chromosomie 8q24 znajduje się c–myc natomiast na 14q32 umiejscowiony jest gen dla łańcuchów ciężkich immunoglobulin. (IgH). W wyniku translokacji, fragment chromosomu 8 zawierający c–myc zostaje przeniesiony na koniec długiego ramienia chromosomu 14, dokładnie na miejsce 14q32 w sąsiedztwo genu dla IgH co powoduje ciągłą stymulację i nadekspresję c–myc przez znajdujące się z pobliżu sekwencje wzmacniające genu IgH. Translokacja może jednocześnie spowodować mutacje w genach regulatorowych c – myc. Translokacja c–myc z chromosomu 8 jest cechą charakterystyczną chłoniaka Burkitta. Jak wspomniano, najczęściej jest on przenoszony w pobliże locus dla IgH (t(8;14)) ale może też być to locus dla łańcuchów lekkich k lub  l (odpowiednio t(2;8), t(8;22)). W chłoniakach grudkowych dochodzi do nadekspresji bcl-2 a w chłoniakach okołogrudkowych (tzw. chłoniaki ze strefy płaszcza grudek chłonnych, ang. mantle zone lymphoma) do nadekspresji genu dla cykliny D1 wskutek odpowiednich translokacji (Tab. 8.7.). Również translokacje obejmujące locus dla receptora antygenu komórek T (TCR) związane są z nadekspresją protoonkogenów w chłoniakach T.

 Tab. 8.7. Onkogeny aktywowane przez translokację.

•    AML (acute myeloid leukemia – ostra białaczka szpikowa)
• ALL (acute lymphoblastic leukemia – ostra białaczka limfoblastyczna)
• TALL (ALL z komórek T)

Translokacja może spowodować fuzję (połączenie) dwóch genów leżących na różnych chromosomach dzięki czemu powstaje gen hybryda będący nowym onkogenem. Przykładem jest chromosom Philadelphia, występujący w przewlekłej białaczce szpikowej i w części ostrych białaczek limfoblastycznych. Występująca tu translokacja t (9;22) przenosi część protoonkogenu c–abl z chromosomu 9 w region chromosomu 22 zwany bcr (ang. break point cluster region (Ryc. 8.28 ). Tym samym c–abl zostaje włączony w jednostkę transkrypcyjną bcr. Powstaje nowy onkogen c–abl–bcr kodujący białko fuzyjne o aktywności kinazy tyrozynowej. W przewlekłej białaczce szpikowej białko to ma masę cząsteczkową 210kD natomiast w ostrej białaczce limfoblastycznej nieco niższą, 180 kD.

Gen MLL (ang. myeloid, lymphoid leukemia) umiejscowiony na 11q23 koduje czynnik transkrypcyjny. Gen ten bierze udział w różnych (ponad 20) translokacjach m.in. w 5% do 10% ostrych białaczek. Również w wielu mięsakach występują specyficzne translokacje, w których udział biorą geny kodujące czynniki transkrypcyjne. Np. gen mięsaka Ewinga (EWS) znajdujący się na 22q12 jest sam czynnikiem transkrypcyjnym i bierze udział w translokacjach z innymi czynnikami transkrypcyjnymi. Translokacje te występują w różnych mięsakach. W samym guzie Ewinga białko fuzyjne kodowane przez gen fuzyjny EWS–FL-1 powoduje nadekspresję c–myc (ponieważ jest transaktywatorem promotora c–myc). Ważniejsze onkogeny aktywowane przez translokację podane są w tabeli N6.

4. Inne zmiany strukturalne protoonkogenów powstałe wskutek np. rekombinacji chromosomowej, delecji lub rearanżacji wewnętrznej.

5. Poddanie protoonkogenu kontroli silnego promtora (np. promotora retrowirusowego wbudowanego w pobliżu lub w obrębie protoonkogenu) lub sekwencji wzmacniającej (np. w związku z niektórymi translokacjami).

Proces powstawania nowotworu jest wieloczynnikowy i wieloetapowy dlatego zazwyczaj wymaga aktywacji więcej niż jednego onkogenu. Aktywacja protoonkogenów może nastąpić już w gametach. Wtedy onkogen będzie znajdował się w każdej komórce organizmu. W takich przypadkach predyspozycje do powstawania nowotworów dziedziczą się dominująco. W ten sposób przenoszony jest c–ret predysponując do wystąpienia gruczolakowatości mnogiej wewnątrzwydzielniczej typu II (MEN II).

Produkty białkowe onkogenów (onkoproteiny).

Jak już wspomnieliśmy protoonkogeny biorą udział w normalnym procesie wzrostu, różnicowania i proliferacji komórek. W takim procesie występuje kilka etapów. Jest on inicjowany przez wiązanie się czynnika wzrostu z jego receptorem w błonie komórkowej. Prowadzi to do pobudzenia receptora i do aktywacji białek przekaźnikowych znajdujących się po wewnętrznej stronie błony komórkowej. Następnie sygnał przeniesiony zostaje do jądra gdzie dochodzi do aktywacji czynników inicjujących transkrypcję DNA. Teraz komórka może wejść w cykl komórkowy zakończony podziałami. W tej kaskadzie wydarzeń biorą udział produkty białkowe różnych protoonkogenów, które należą do kilku czynnościowo różnych klas (Tab. 8.8.).

 Tab. 8.8 Onkogeny i onkoproteiny biorące udział w powstawaniu nowotworów człowieka.

Mogą one więc wykazywać funkcje czynników wzrostu lub ich receptorów, białek zaangażowanych w przekazywaniu (transdukcji) sygnału z błony komórkowej do wnętrza komórki, czynników regulujących transkrypcję DNA oraz regulatorów cyklu komórkowego. Onkoproteiny czyli produkty onkogenów będą to zmienione (wskutek aktywacji protoonkogenów) białka, które przypominają białka kodowane przez protoonkogeny ale na ich syntezę nie mają wpływu czynniki wzrostu. Białka te nie mają także istotnych elementów regulatorowych. Najlepiej podzielić je podobnie jak białka protoonkogenów na grupy w zależności od roli jaką spełniają w procesie proliferacji komórki.

Czynniki wzrostu i ich receptory. Obecnie znanych jest szereg czynników wzrostu np. płytkowy czynnik wzrostu (ang. Platelet Derived Growth Factor – PDGF), czynnik wzrostu fibroblastów (ang. Fibroblast Growth Factor – FGF), czynnik wzrostu naskórka (ang. Epidermal Growth Factor – EGF), insulino–podobny czynnik wzrostu (ang. Insulin–like Growth Factor – IGF), transformujący czynnik wzrostu a i b (ang. Transforming Growth Factor – TGF-a, TGF-b). Czynniki wzrostu wiążąc się ze swoistymi receptorami w błonie komórkowej uruchamiają kaskadę wydarzeń molekularnych prowadzącą do wzrostu, różnicowania i proliferacji. Jednak sama nadmierna produkcja tych czynników nie jest w stanie spowodować transformacji nowotworowej. Stanowi ona raczej podatną glebę, która zwiększa wydatnie prawdopodobieństwo wystąpienia mutacji i tą drogą przyczynia się do onkogenezy. Natomiast w już istniejącym nowotworze nadprodukcja czynników wzrostu poprzez mechanizm autokrynnej i parakrynnej stymulacji komórek nowotworowych może wydatnie przyspieszyć jego wzrost. Działanie onkogenne mutacji lub nadekspresji genów kodujących czynniki wzrostu należy rozpatrywać w świetle powyższych uwag. Np. gwiaździaki i mięsaki kościotwórcze produkują PDGF za co odpowiedzialny jest c-sis (kodujący jego łańcuch b). Prawdopodobnie dochodzi tu dodatkowo do autokrynnej stymulacji komórek nowotworowych gdyż komórki w/wym nowotworów wykazują również obecność receptorów dla PDGF. W szeregu innych nowotworów również stwierdzamy aktywowane onkogeny kodujące czynniki wzrostu. Np. hst–1 i int–2 (kodujące czynniki podobne do FGF) w rakach żołądka i sutka oraz w czerniakach złośliwych.

Protoonkogeny kodujące receptory czynników wzrostu mogą być aktywowane przez mutacje lub rearanżacje, występuje też nadekspresja tych receptorów, która m.in. może być wynikiem amplifikacji genów. Związek zmian dotyczących receptorów czynników wzrostu z transformacją nowotworową najlepiej zrozumieć na przykładzie EGFR. Podobnie jak inne receptory czynników wzrostu posiada on domenę zewnątrzkomórkową, śródbłonową i wewnątrzkomórkową. Ta ostatnia posiada aktywność kinazy tyrozynowej. Przyłączenie czynnika wzrostu do receptora wywołuje jego krótkotrwałą aktywację prowadzącą do dimeryzacji receptora i autofosforylacji reszt tyrozynowych, która z kolei uruchamia kaskadę reakcji cytoplazmatycznych transdukcji sygnału. Receptory kodowane przez onkogeny wykazują permanentną dimeryzację oraz aktywację receptora bez obecności czynnika wzrostu. Inaczej mówiąc komórka zachowuje się tak jakby była stale aktywowana przez wiązanie się czynnika wzrostu z jego receptorem. Np. w zespole MEN 2A mutacja punktowa domeny zewnątrzkomórkowej protoonkogenu ret powoduje permanentną (konstytutywną) dimeryzację i aktywację receptora GDNF (który jest receptorem o aktywności kinazy tyrozynowej występującym w komórkach neuroendokrynnych takich jak rdzeń nadnercza, komórki C tarczycy lub komórki prekursorowe przytarczyc). W zespole MEN 2B aktywacja receptora jest spowodowana mutacją punktową domeny wewnątrzkomórkowej.

Amplifikacja genu wywołuje nadekspresję receptora co zwiększa wrażliwość komórek na działanie nawet małych ilości czynnika wzrostu. Nadekspresja EGFR dotyczy najczęściej trzech przedstawicieli tej rodziny receptorów tzn. erb B1, erb B2 i erb B3. Nadekspresja erb B1 występuje w większości raków płaskonabłonkowych płuca, rzadziej w rakach przewodu pokarmowego i pęcherza moczowego oraz w astrocytoma. Natomiast nadekspresja erb B2/neu/HER 2  występuje w około 20% gruczolakoraków sutka i jajnika a także w rakach żołądka, płuc i ślinianek. Wykazano, że w rakach sutka jest ona związana ze złym rokowaniem. Nadekspresja erb B3 też występuje w rakach sutka.

W wymienionych wyżej rodzinnie występujących zespołach zmutowany ret przekazywany jest w gametach. Natomiast  sporadycznie występujące raki brodawczakowate tarczycy związane są z rearanżacjami ret w komórkach somatycznych. Również mechanizm aktywacji receptora jest tutaj inny. Na skutek rearanżacji ret domenę wewnątrzkomórkową receptora tworzy białko fuzyjne, które jest permanentnie aktywowane.

Białka przekaźnikowe. Szereg różnych biochemicznie białek jest normalnie zaangażowanych w reakcjach cytoplazmatycznych transdukcji sygnału od błony komórkowej do jądra. Zmutowane ich wersje permanentnie pobudzają mitogenezę indukowaną czynnikami wzrostu.

Klasycznym przykładem jest białko p21, produkt genu ras zlokalizowane po wewnętrznej stronie błony komórkowej i należące do białek wiążących nukleotydy guaninowe. W postaci nieczynnej białko to jest związane z GDP (ras – GDP), natomiast w postaci czynnej z GTP (ras – GTP). Czynna postać p21 aktywuje szlak kinaz MAP co ostatecznie prowadzi do aktywacji czynników transkrypcyjnych w jądrze (Ryc. 8.29 jest rysunek). W prawidłowej komórce czynnikiem regulującym działanie białka p21 są białka aktywujące GTPazę (ang. GTPase Activating Proteins – GAPs), które wiążą się z ras – GTP i zwiększają wielokrotnie proces hydrolizy GTP do GDP błyskawicznie unieczynniając białko p21 oraz przekazywanie przez nie sygnału (normalne białko p21 też posiada pewną aktywność GTPazową). Produktem zmutowanego ras jest zmienione białko p21, które co prawda nadal wiąże GAP ale w ślad za tym aktywność GTPazowa ras nie zwiększa się. W efekcie zmutowane białko znajduje się ciągle w aktywnej związanej z GTP postaci i w sposób ciągły przekazuje sygnał indukujący mitogenezę. Komórka zachowuje się jakby stale była stymulowana przez czynnik wzrostu. Jak już wspomniano mutacje punktowe genów z rodziny ras są bardzo charakterystyczne dla niektórych nowotworów np. mutacje Ki–ras w raku trzustki oraz w raku drobnokomórkowym płuca oraz Ha–ras w gruczolakorakach jelita grubego.

Spośród niereceptorowych, cytoplazmatycznych kinaz tyrozynowych tylko nieliczne ulegają permanentnej aktywacji w nowotworach człowieka. Do tych wyjątków należy protoonkogen abl, który ma aktywność kinazy tyrozynowej. Ulega ona zwielokrotnieniu po translokacji t (9;22) i utworzeniu hybrydy abl–bcr (str. …). Dokładny mechanizm działania genu hybrydowego nie został poznany przypuszczalnie odgrywa on rolę i w stymulacji mitogenezy i w kontroli apotozy.

Białka jądrowe. Produkty białkowe niektórych genów mogą działać jako czynniki transkrypcyjne genów związanych ze wzrostem i proliferacją. Przyłączają się one do specyficznych miejsc DNA i kontrolują transkrypcję sąsiednich genów. A zatem, mutacje genów kodujących czynniki transkrypcyjne mają wpływ destabilizujący na procesy wzrostu i proliferacji istotne w transformacji nowotworowej. Typowym przykładem mogą być geny z rodziny myc: amplifikacja N–myc występuje w neuroblastoma, c–myc w różnych rakach m.in. w rakach sutka, płuca i jelita grubego, L–myc jest amplifikowany w rakach drobnokomórkowych płuc.

W normalnych komórkach, po otrzymaniu przez nie sygnału do podziału następuje przejściowa ekspresja protoonkogenu myc. Jednak aktywacja transkrypcji zależy nie tylko od poziomu produktu protoonkogenu myc ale również od obecności innych białek (tzw. max i mad). Kompleksy myc–max stymulują proliferację, kompleksy mad–max ją hamują. Ta delikatna i ściśle regulowana równowaga zostaje zaburzona w przypadku nadekspresji białka myc lub w  przypadku aktywacji myc związanej z translokacją (jak np. w t (8;14) w chłoniakach Burkitta). Na marginesie zauważmy, że myc bierze udział nie tylko w procesach proliferacji ale jego aktywacja przy braku czynników wzrostu może indukować apoptozę.

Do białek jądrowych należą też czynniki regulujące cykl komórkowy. Przechodzenie komórki przez poszczególne fazy cyklu komórkowego jest regulowane przez cykliny i cyklino–zależne kinazy (ang. Cyclin–Dependent Kinases-CDK)(Ryc. 8.30). Nadekspresja tych białek będzie związana ze wzrostem proliferacji co może być jednym z czynników promujących transformację nowotworową. Amplifikacja genu CDK4 występuje w glejakach, czerniakach i mięsakach natomiast nadekspresja genów kodujących cyklinę D występuje m.in. w rakach sutka, wątroby i przełyku oraz w chłoniakach okołogrudkowych.

Geny supresorowe transformacji nowotworowej

Białka kodowane przez geny supresorowe hamują proliferację komórek (podczas gdy onkoproteiny stymulują proliferację). Geny supresorowe

 Tab. 8.9. Geny supresorowe w nowotworach człowieka

• Białka kodowane przez geny nr 1 – 5 są zlokalizowane w jądrze, 6 – 8 w cytoplazmie
  a 9 – 10 w błonie komórkowej.
• ca – carcinoma

 wykazują w komórce recesywny efekt działania. Oznacza to, że obydwa allele genu muszą być inaktywowane czyli musi nastąpić utrata funkcji genu aby rozwinął się nowotwór.

Gen Rb. Gen Rb był pierwszym poznanym genem supresorowym. Jest on  umiejscowiony na chromosomie 13q14. Gdy oba allele genu Rb w retinoblaście zostaną inaktywowane lub utracone rozwija się z niego nowotwór złośliwy zwany siatkówczakiem (retinoblastoma). W przypadkach siatkówczaków dziedzicznych (40%) we wszystkich komórkach organizmu brakuje jednego allelu Rb wskutek delecji lub inaktywacji przez punktową mutację.  (zmiana dziedziczy się autosomalnie dominująco). Jeżeli teraz wystąpi somatyczna mutacja w drugim (niezmienionym) allelu któregokolwiek retinoblastu (której prawdopodobieństwo jest duże), obydwa allele są inaktywowane i rozwija się nowotwór. W przypadkach sporadycznych somatyczne mutacje (niekiedy pod postacią utraty całego chromosomu 13) muszą wystąpić w obu allelach genu Rb w jednym retinoblaście (prawdopodobieństwo takiego wydarzenia jest małe). Siatkówczaki dziedziczne występują w młodszym wieku, są często wieloogniskowe i obustronne. Dzieci te mają również zwiększone ryzyko wystąpienia osteosarcoma lub innych mięsaków tkanek miękkich. Inaktywację genu Rb stwierdzono też w niektórych innych nowotworach np. w raku drobnokomórkowym płuca lub raku sutka. Badania siatkówczaków na poziomie molekularnym w pełni potwierdziły hipotezę „dwóch mutacji” (ang. two hits) Knudsona, w której zaproponował on przed laty, że występowanie dziedzicznych i sporadycznych postaci siatkówczaka wymaga dwóch odrębnych mutacji. W postaci dziedzicznej pierwsza mutacja jest dziedziczona od jednego z rodziców i dlatego występuje we wszystkich komórkach somatycznych. Druga mutacja zachodzi w jednym z retinoblastów. W postaciach sporadycznych obie mutacje występują w jednym retinoblaście. Dziecko z wrodzonym zmutowanym allelem Rb jest heterozygotą (w locus Rb). Gdy pozostały, normalny allel Rb ulegnie mutacji wystąpi w komórce utrata tej heterozygotyczności. Nie tylko gen Rb ale również inne geny supresorowe identyfikuje się obserwując utratę heterozygotyczności. Gen Rb koduje białko – fosfoproteinę (pRb), która odgrywa kluczową rolę w kontroli cyklu komórkowego. Stopień fosforylacji pRb decyduje o wejściu komórki w cykl komórkowy. W postaci aktywnej (hypofosforylacja pRb) uniemożliwia komórce przejście z fazy G₁ do fazy S cyklu komórkowego. Gdy pRb zostaje inaktywowane przez fosforylację (pRb–P – hyperfosforylacja) komórka może przejść z G₁ do S i dalej aż do fazy M, w której następuje defosforylacja i znowu pRb zostaje w postaci aktywnej. W komórkach spoczynkowych (G₀ , G₁) pRb uniemożliwia replikację przez wiązanie się z czynnikami transkrypcyjnymi z grupy E2F co uniemożliwia aktywację genów zależnych od E2F. W stanie nadmiernej fosforylacji pRb uwalnia E2F, które aktywują transkrypcję genów, niezbędnych do wejścia komórki w fazę S,. Z powyższego wynika, że gdy pRb jest nieobecne w komórce (np. wskutek delecji), komórka w sposób nieskrępowany może wejść w cykl komórkowy. Ale uwolniony w ten sposób E2F (wespół z p53) może również uruchomić program apoptozy. Z drugiej strony mutacje genów, które kontrolują fosforylację pRb (p16, cyklina D, CDK4) mogą wywoływać taki sam efekt jak utrata pRb.

Jedną z podstawowych przyczyn transformacji nowotworowej jest utrata kontroli nad przebiegiem cyklu komórkowego dlatego w większości nowotworów człowieka występują mutacje w przynajmniej jednym z głównych regulatorów cyklu komórkowego jakimi są Rb, CDK-4, cyklina D lub p16.

Gen p53. Gen p53 jest genem supresorowym zlokalizowanym na chromosomie 17p13. Mutacje w tym genie występują w ponad połowie nowotworów człowieka i są naczęściej występującymi zmianami genetycznymi w tych nowotworach. Mutacja w genie p53 może być zmianą wrodzoną (zespół Li–Fraumeni), występuje wówczas w jednym allelu każdej komórki organizmu predysponując do rozwoju nowotworów złośliwych. Zgodnie z hipotezą Kundsona druga mutacja w którejkolwiek komórce organizmu wywołuje utratę heterozygotyczności w locus genu p53. Rzeczywiście, u chorych z zespołem Li–Fraumeni (który dziedziczy się autosomalnie dominująco) występują różne nowotwory najczęściej mięsaki, rak sutka, guzy mózgu, białaczki i raki kory nadnercza. U poszczególnego chorego wystąpić może kilka różnych nowotworów pierwotnych, pojawiają się one w młodszym wieku niż guzy sporadyczne. Chorzy z tym zespołem mają 25 razy większe ryzyko wystąpienia złośliwego nowotworu do 50 r. ż. Znacznie częściej niż zespół Li–Fraumeni stwierdza się mutacje w obydwu allelach p53 w guzach występujących sporadycznie. Występują one w różnych rakach w tym w raku sutka, płuca i jelita grubego. Gen p53 może być inaktywowany (unieczynniony) przez wrodzone lub somatyczne mutacje albo przez wiązanie z niektórymi białkami, które prowadzi do degradacji p53. Do tych białek należą mdm2 oraz białka transformujące niektórych wirusów DNA np. białka E6 wirusów HPV. W niektórych mięsakach występuje nadekspresja mdm2.

Białko p53 występuje w jądrze komórki gdzie wiąże się z DNA wpływając na wiele funkcji komórki m.in. kontroluje transkrypcję szeregu innych genów, wpływa na syntezę DNA i apoptozę. W warunkach fizjologicznych okres półtrwania p53 wynosi tylko ok. 20 min. Białko p53 uniemożliwia wejście w cykl komórkowy tym komórkom, które mają uszkodzony DNA. Dlatego nazywa się je czasem „strażnikiem genomu” lub lepiej, „aniołem stróżem genomu”. Unieczynnienie p53 (np. wskutek mutacji) pozwala komórkom z uszkodzonym DNA wejść w mitozę co prowadzi do propagacji uszkodzenia i dalszych zmian w DNA ułatwiających transformację nowotworową. W przeciwieństwie do pRb, które „stoi przy bramie” punktu kontrolnego normalnego cyklu komórkowego, p53 pojawia się w cyklu komórkowym (jak anioł raczej niż ciągle stojący strażnik) aby go wstrzymać wtedy gdy DNA komórki jest uszkodzone albo przez promieniowanie jonizujące albo działające mutagennie czynniki chemiczne lub promieniowanie ultrafioletowe. Sposób w jaki p53 to robi jest fascynujący. Uszkodzenie DNA powoduje szybki wzrost ilości i aktywację p53, które wiąże się z DNA indukując transkrypcję szeregu genów które biorą udział w naprawie DNA lub apoptozie. Wśród syntetyzowanych białek jest p21/WAF, które hamuje tworzenie kompleksów cyklina/CDK co uniemożliwia fosforylację pRb, które z kolei jest potrzebne aby komórka mogła wejść w fazę S. Dzięki temu cykl komórkowy zostaje zatrzymany w późnej fazie G₁. Drugim syntetyzowanym białkiem jest GADD45 (ang. Growth Arrest and DNA Damage – zahamowany wzrost i uszkodzenie DNA). Białko to również bierze udział w zahamowaniu cyklu w G₁ a jednocześnie w naprawie DNA. Teraz komórka ma dwa wyjścia: albo szybko naprawić uszkodzony DNA i wejść w fazę S albo ulec apoptozie. Nad tymi procesami „czuwa” właśnie p53. Jeżeli naprawa DNA jest udana, p53 aktywuje gen mdm2, którego produkt białkowy wiąże się z nim i powoduje obniżenie poziomu czynnego p53 co otwiera komórce wejście w fazę S. Jeżeli naprawa jest nieudana p53 aktywuje geny indukujące apoptozę (bax i IGF – BP3). Białko kodowane przez bax wiąże i unieczynnia bcl-2 (które jest białkiem hamującym apoptozę).

Tak więc gdy dojdzie do uszkodzenia DNA w normalnej komórce, p53 stymulując aktywację transkrypcji odpowiednich genów zatrzymuje ją w G₁ i kieruje komórkę na drogę naprawy DNA a jeżeli ta się nie uda, na drogę apoptozy (Ryc 8.31 jest rysunek). Dzięki tym mechanizmom nie dochodzi do przeniesienia mutacji na komórki potomne. Mutacje genu p53 najczęściej dotyczą domeny wiążącej się z DNA. W takim przypadku jeżeli mutacja dotyczy obydwu alleli nie dochodzi do indukcji transkrypcji odpowiednich genów a zatem nie ma zatrzymania komórki w fazie G₁, nie ma naprawy DNA, nie ma indukcji apoptozy, natomiast mutacje przeniesione zostają do komórek potomnych prowadząc do transformacji nowotworowej.

Rozszyfrowanie związku p53 z naprawą DNA i apoptozą znalazło praktyczne wykorzystanie w terapii nowotworów. Ponieważ zarówno radio– jak i chemioterapia uszkadzają DNA zgodnie z tym co powiedzieliśmy wyżej nowotwory zawierające prawidłowy gen p53 lepiej reagują na leczenie gdyż komórki z uszkodzonym DNA podlegają apoptozie (np. ostre białaczki u dzieci). Przeciwnie guzy ze zmutowanym p53 są raczej oporne na radio– i chemioterapię (np. raki jelita grubego)

W sytuacji niedotlenienia, komórki nowotworowe które mają prawidłowe allele p53 ulegają apoptozie, natomiast komórki ze zmutowanym p53 są na apoptozę oporne. Może to mieć znaczenie przy planowaniu terapii z zastosowaniem czynników antyangiogennych.

Gen p73. Gen ten umiejscowiony na chromosomie 1p36, koduje białko o właściwościach zbliżonych do p53. Delecje obejmujące p73 występują w różnych nowotworach m.in. w rakach sutka.

Geny BRCA–1 i BRCA–2

Około 5% do 10% raków sutka występuje rodzinnie i spośród tych w 80% występują mutacje w genach supresorowych BRCA–1 i BRCA–2. W rakach sutka sporadycznych mutacje te występują niezwykle rzadko. Gen BRCA–1 jest umiejscowiony na chromosomie 17q21 a BRCA–2 na 13q12. Osoby które odziedziczyły mutacje w tych genach mają zwiększone ryzyko wystąpienia raka sutka. Dla nosicieli mutacji w BRCA–1 ryzyko to wynosi ponad 70% w wieku 80 lat, występuje też dodatkowo zwiększone ryzyko raka jajnika (30% – 60% w wieku 70 lat) i mniejsze raka jelita grubego i gruczołu krokowego.

Rak sutka w tej grupie występuje średnio około 10 lat wcześniej niż u nosicieli mutacji w BRCA–2. Około 13% raków stanowią raki rdzeniaste i raki o większym stopniu złośliwości. Dla nosicieli mutacji w BRCA–2 ryzyko wystąpienia raka sutka wynosi ponad 60% w wieku 70 lat. Dodatkowo istnieje zwiększone ryzyko wystąpienia raka jajnika, pęcherza moczowego a u mężczyzn raka sutka i gruczołu krokowego. Białka kodowane przez obydwa geny sa białkami jądrowymi. Czynności obydwu genów nie są dokładnie poznane. Przypuszcza się, że mogą być zaangażowane w naprawie DNA i regulacji transkrypcji.

Gen APC (ang. Adenomatous polyposis coli, gruczolakowata polipowatość jelita grubego), W rodzinnej polipowatości u osób, które odziedziczyły jeden zmutowany allel występują setki i tysiące gruczolaków jelita grubego już w drugiej i trzeciej dekadzie życia. Pojawiają się one gdy następuje utrata obydwu alleli genu APC. Następnie szereg dodatkowych mutacji prowadzi do powstania raka w niektórych polipach. W większości sporadycznych gruczolaków i gruczolakoraków występują podobne zmiany na poziomie molekularnym.

Białko APC występuje w cytoplazmie gdzie pełni rolę negatywnego regulatora funkcji przekaźnikowej b-kateniny. Inaktywacja APC podnosi poziom b-kateniny w cytoplazmie, która przemieszcza się do jądra stymulując proliferację komórki. Mutacje APC lub b-kateniny stwierdzono też w czerniakach. Obniżona adhezyjność międzykomórkowa w nowotworach złośliwych może być związana z zaburzeniami wiązania b-kateniny z cytoplazmatyczną domeną E–kadheryny.

Gen NF–1. U osób, które odziedziczyły jeden zmutowany allel tego genu rozwija się neurofibromatosis typu I, w której występują liczne nerwiakowłókniaki. Niektóre z nich mogą przekształcić się w neurofibrosarcoma. Białko kodowane przez gen NF–1 aktywuje GTPazę, co ułatwia przejście ras z postaci aktywnej (GTP–ras) w postać nieaktywną (GDP-ras). Gdy NF–1 jest inaktywowany ras pozostaje permanentnie w postaci aktywowanej.

Gen NF–2. Gen NF–2 koduje białko merlinę, które wiąże się z aktyną i z białkiem CD44. Mutacje tego genu prawdopodobnie zaburzają przekazywanie sygnałów na granicy macierz pozakomórkowa – komórka. Wrodzone mutacje tego genu predysponują do rozwoju neurofibromatosis typu II (str.    ). W niektórych wyściółczakach (ependymoma) i oponiakach (meningioma) mogą wystąpić somatyczne mutacje obydwu kopii tego genu.

E–kadheryna. Mutacje genu kodującego E–kadherynę lub genów kodujących kateniny, hamują ekspresję E–kadheryny na powierzchni komórek co zmniejsza kohezję międzykomórkową ułatwiając inwazję i występowanie przerzutów m.in. w rakach jelita grubego, przełyku, jajnika, sutka, gruczołu krokowego. U osób, które odziedziczyły mutacje genu E–kadheryny opisano zwiększone ryzyko występowania raka żołądka.

Receptor TGF-b (transformujący czynnik wzrostu b). TGF-b wiążąc się ze swym receptorem stymuluje syntezę inhibitorów CDK, które hamują cykl komórkowy. Mutacje tego receptora stwierdzono np. w niektórych rakach jelita grubego.

DCC (Deleted in colon carcinoma). Na chromosomie 18q21 jest umiejscowiony gen DCC (ulegający delecji w raku jelita grubego). Nie jest jeszcze wyjaśnione czy jest to gen supresorowy jak dotychczas sądzono. Być może inny gen w tym regionie bierze udział w karcinogenezie raka jelita grubego.

VHL Gen VHL (Von Hippel–Lindau) zlokalizowany jest na chromosomie 3p i koduje białko, które hamuje jeden z etapów syntezy (wydłużanie) RNA. Mutacje tego genu stwierdza się w zespole Von Hippel-Lindau, na który składają się:

•  haemagioblastoma cerebelli (et retinae)
•  phaeochromocytoma
•  carcinoma renis
•  cystes renum, pancreatis, hepatis, epididymis

Mutacje genu VHL występują też w sporadycznych rakach nerki.

WT–1. Białko kodowane przez gen WT–1 (na chromosomie 11p13) prawdopodobnie negatywnie reguluje transkrypcję genów stymulujących wzrost. Mutacje tego genu występują we wrodzonych i sporadycznych postaciach guza Wilmsa.

Geny regulujące apoptozę

Proliferacja komórek regulowana jest nie tylko przez omówione powyżej onkogeny i geny supresorowe ale również przez geny regulujące apoptozę. Można je ogólnie podzielić na geny hamujące apoptozę (działają antagonistycznie) np. bcl-2, bcl-xL oraz geny proapoptotyczne (działają agonistycznie) np. bax, bad, bid, bcl-xS).

W transformacji nowotworowej duże znaczenie ma niepohamowana proliferacja, w której istotną rolę odgrywają onkogeny i mutacje genów supresowych. Ale ułatwiać transformację nowotworową może też zahamowanie apoptozy gdyż wydłuża okres przeżycia komórek przez co zwiększa się liczebność populacji komórek narażonych na działanie czynników mutagennych oraz prawdopodobieństwo wystąpienia mutacji w poszczególnych komórkach tej populacji. Np. nadekspresja bcl-2 w limfocytach hamując apotpozę wydłuża ich okres przeżycia zwiększając prawdopodobieństwo wystąpienia postaci grudkowej chłoniaka złośliwego. W ponad 80% tych chłoniaków stwierdza się charakterystyczną translokację t(14;18), która powoduje, że transkrypcyjnie aktywny region 14q32 (gdzie mieszczą się geny kodujące ciężkie łańcuchy immunoglobulin) znajduje się w pobliżu bcl-2 (zlokalizowanego na 18q21). W wyniku tych zmian strukturalnych dochodzi do nadekspresji bcl-2.

Gen bcl-2 jest zlokalizowany na zewnętrznej błonie mitochondriów, w siateczce śródplazmatycznej oraz na błonie jądrowej. Białka z rodziny bcl-2 biorą udział w regulacji aktywacji kaspaz czyli enzymów proteolitycznych, które są egzekutorem wyroku śmierci na komórkę. Kaskada molekularnych wydarzeń, które prowadzą do apoptozy nie jest jeszcze szczegółowo wyjaśniona. Przypuszczalnie białka z rodziny bcl-2 regulują przepływ cytochromu C z wnętrza mitochondrium do otaczającej go cytoplazmy. Może to odbywać się w ten sposób, że bax tworzy kanał w błonie mitochondrium a bcl-2 hamuje tę jego aktywność. Wydaje się, że kluczową rolę w skierowaniu (lub nie) komórki na drogę apoptozy odgrywa stosunek antagonistów do agonistów apoptozy z rodziny bcl-2. Oczywiście czynniki, które wpływają na transkrypcję genów zaangażowanych w procesie apoptozy będą miały wpływ na jego kierunek i przebieg. Np. p53 i c-myc mogą oddziaływać proapoptotycznie, p53 poprzez stymulację syntezy bax a c-myc gdy komórki aktywowane przez ten onkogen nie będą miały wystarczającej ilości czynników wzrostu. Jednak nadekspresja bcl-2  może zahamować apoptozę w komórkach aktywowanych przez c-myc ułatwiając tym samym ich transformację nowotworową.

Geny regulujące naprawę DNA

W czasie replikacji DNA, komórki będące w cyklu komórkowym popełniają błędy, które mogłyby być w fazie M przeniesione na komórki potomne. Z drugiej strony komórki organizmu są stale, w ciągu całego życia, narażone na działanie czynników mutagennych (np. promieniowanie jonizujące, czynniki chemiczne, promieniowanie ultrafioletowe). Uszkodzenia DNA są więc czymś częstym i naturalnym wśród miliardów komórek organizmu człowieka. Na szczęście istnieją sprawne mechanizmy szybkiej naprawy DNA zapobiegające mutacjom, które mogłyby również dotyczyć genów odpowiedzialnych za regulację proliferacji wzrostu i różnicowania komórek. Gdyby nie te mechanizmy, nowotwory występowałyby znacznie częściej i w znacznie młodszym wieku, nie wiadomo czy człowiek mógłby dożyć do okresu umożliwiającego prokreację.

W czasie replikacji DNA pary zasad mogą zostać błędnie sparowane. Za naprawę tych błędów odpowiedzialne są geny naprawcze błędnie sparowanych zasad (ang. mismach repair genes) zwane też genami mutatorami. Geny te dziedziczą się tak jak geny supresorowe ale różnią się od nich tym, że ich produkty białkowe nie wpływają bezpośrednio na proces poliferacji. Mutacje w obrębie tych genów powodują, że wraz z każdym podziałem gromadzą się w komórkach liczne błędy replikacyjne (mutacje) w różnych genach również w genach supresorowych lub w protoonkogenach. Część tych mutacji jest letalna. Inne mogą prowadzić do transformacji nowotworowej. Mutacje genów regulujących naprawę DNA związane są z występowaniem rodzinnie uwarunkowanych zespołów predyspozycji do określonych nowotworów. Jednym z nich jest zespół niepolipowatego raka jelita grubego (zespół Lynch II, znany też pod akronimem HNPCC od ang. Hereditary Non Polyposis Colon Cancer). W zespole tym stwierdzamy rodzinne występowanie raków jelita grubego (głównie kątnicy i części wstępującej), które nie pojawiają się na podłożu polipów gruczolakowatych. Występują tu odziedziczone mutacje w genach hMSH2 (w ok. 50% rodzin), hMLH1 (ok. 30%), hPMS1 lub hPMS2 (ok. 20%). Zmiany dziedziczą się wg „dwumutacyjnej” hipotezy Kundsona tzn. odziedziczona mutacja jednego z w/wym genów znajduje się we wszystkich komórkach, druga mutacja w komórkach nabłonka jelita grubego może prowadzić do transformacji nowotworowej. M.in. dlatego raki jelita grubego w HNPCC występują już poniżej 50 r. życia tzn. wcześniej niż raki sporadyczne. Mutacje w/wym genów mutatorowych u chorych z HNPCC umożliwają m.in. występowanie mutacji genów kodujących bax (skutkiem bedą zaburzenia apoptozy) i receptora dla TGF-b (uniemożliwia to hamowanie proliferacji przez działanie TGF‑b).

Do innych chorób charakteryzujących się rodzinnie występującą podatnością na nowotwory, u podłoża których leżą wrodzone mutacje w obrębie genów naprawczych DNA należą m.in.: ataxia teleangiectasia, xeroderma pigmentosum i zespół Blooma. W ataxia teleangiectasia występuje m.in. nadwrażliwość na promieniowanie jonizujące i podatność na nowotwory układu limfatycznego. Uważa się, że białko kodowane przez gen AT rozpoznaje uszkodzenie DNA wywołane promieniowaniem jonizującym, prowadząc do aktywacji p53 co z kolei wstrzymuje cykl komórkowy dla naprawy DNA. U osoby z mutacją w obu allelach AT cykl komórkowy nie zostaje zatrzymany a komórka dzieli się propagując uszkodzenie DNA. U osób będących heterozygotami można by się spodziewać zwiększonego ryzyka rozwoju nowotworów nawet po małych dawkach (być może nawet diagnostycznych) promieniowania jonizującego. Nadwrażliwość na promieniowanie jonizujące występuje też w zespole Blooma (predyspozycja do nowotworów oraz zaburzenia rozwojowe). W xeroderma pigmentosum stwierdza się nadwrażliwość na promieniowanie ultrafioletowe. Wrodzone mutacje genów naprawy nukleotydów powodują, że wywołane przez promieniowanie UV uszkodzenia DNA nie są naprawiane co prowadzi do rozwoju raka skóry.

Telomery i telomeraza.

Oprócz omówionych powyżej onkogenów, genów supresorowych i mutatorowych, na replikację komórek mają też wpływ telomery i enzym telomeraza. Telomery znajdujące się na końcach chromosomów ulegają skróceniu przy każdym podziale mitotycznym. Gdy zostaną skrócone poza pewną granicę komórka nie może się już dzielić i obumiera. Skracaniu telomerów zapobiega enzym telomeraza, której utrata jest równoznaczna z utratą zdolności komórki do replikacji. W komórkach nowotworowych nie tylko występują zaburzenia omówionych powyżej mechanizmów regulujących wzrost i proliferację. W wielu nowotworach stwierdza się obecność telomerazy lub inne mechanizmy wydłużające telomery co umożliwia nieustaną proliferację komórek nowotworowych.

Odwiedzający wpisali takie problemy: